盐酸羟胺溶液和三乙醇胺溶液在戊二醛含量测定中的作用

一、试剂 1. O.25mol/L 硫酸标准液： 2. 6.5%三乙醇胺溶液： 3. 盐酸经胺中性溶液：取17.5g 盐酸羟胺放于1 OOOml 烧杯内加蒸馆水75ml 使之溶解，加异丙醇稀释至500ml. 摇匀，再加人0.04 %澳酚蓝乙醇溶液15ml ，然后用6.5%三乙醇胺溶液滴定至蓝色...

固定化活细胞的制备方法主要有物理吸附法和包埋法两种。

1．物理吸附法

带电的微生物细胞和载体之间的静电相互作用，使细胞体吸附固定在硅藻土、木材、玻璃、陶瓷和塑料等载体上。如酵母细胞是带负电的，在固定时要选择带正电的载体。在PH4时，热带假丝酵母、酿酒酵母等在陶瓷表面上的吸附程度较大，载体表面的40~70%被细胞牢固吸附，不会被高流培养液冲掉。载体的性质也影响细胞与载体之间的相互作用，主要是载体的成分、表面电荷、表面积和PH的影响。所有的玻璃和陶瓷都是由不同比例的氧化硅、氧化镁等组成，如将玻璃等放在溶液中，在它的表面会发生离子交换，形成不再是铝、硅等的氧化物，而为相应的氢氧化物。载体表面的羟基可被微生物细胞表面的氨基或羧基所取代，在细胞与载体之间形成键。物理吸附法固定化活细胞的酶活性不受影响，但吸附过程相当复杂，吸附过程与微生物的性质、载体的特性及细胞与载体之间发生的相互作用有关，只有这些参数配合恰当时才能形成稳定的微生物细胞-载体复合物。

物理吸附法固定微生物细胞现已广泛用于废水处理工程——生物膜法，中国科学院微生物研究所应用自养菌和异养菌的混合菌，吸附于玻璃钢蜂窝填料繁殖成生物膜，用以处理含硫氰酸钠的腈纶废水。北京工业大学应用驯化的混合菌吸附于活性炭的大孔及其表面，用以处理印染废水等。

2．包埋法

将微生物细胞用物理的方法包埋在琼脂、海藻酸钠、明胶、聚丙烯酰胺和聚乙烯醇（PVA）等凝胶载体内，使微生物细胞固定化。一般的包埋成形法比较复杂、机械性能差、易磨损、不适于大批量生产。因而近年来一些学者又研究了一种制备珠型固定化细胞技术。

1）琼脂凝胶包埋法，称取4g琼脂或琼脂糖溶于50ml 0.2M pH7.0磷酸缓冲液中，加热溶解后，冷却到55℃左右，将细胞浓度为60%左右细菌悬浮液于40℃下保温，然后与琼脂溶液混合均匀。用注射器针头将热的混合液滴入冷的甲苯溶液，四氯乙烯溶液或液体石腊内，冷却形成2~3mm直径的小球。或将热琼脂-细菌混合液流加到搅拌下的500ml30℃的醋酸丁酯中，加完后继续搅拌3分钟，到混合物分散成小滴，迅速加入300ml冷的醋酸丁酯，再搅拌2~5分钟，倾去醋酸丁酯，抽滤干，用缓冲液洗至无醋丁酯味，即制成珠型固定化细胞，小珠约在1~3mm。使用前将球形固定化细胞放入消毒好营养液中30℃活化24小时后再用。

2）海藻酸钙凝胶包埋法 称取2g海藻酸钠，加30ml生理盐水于高压灭菌锅中加热溶解、冷却到40℃，取20ml与20ml细胞浓度为50%的细菌悬浮混合均匀，然后用注射器针头滴加到0.1M氯化钙或4%的氯化钡溶液中，边滴边摇，使其形成2mm直径球型小珠，然后用生理盐水洗涤。或将混合液流加到搅拌下的200~500ml醋酸丁酯中，当分散成小滴后，迅速加入5ml 0.1M的二氯化钙溶液,继续搅拌5~10分钟,自然沉降,倾去醋酸丁脂,再加入50ml 0.1M的二氯化钙溶液,浸泡1小时,进一步固化,然后用蒸馏水彻底洗涤,即得直径为1~3mm珠型固定化细胞。干后可保存于低温下，使用前需放入消毒好的营养液中30℃活化24小时后再用。由于磷酸盐会破坏凝胶的结构，因而在使用海藻酸钠固定细胞时尽量防止磷酸盐的加入。

3）明胶包埋法 称取6g明胶，加入50ml 0.1M pH7.0的磷酸缓冲液，加热溶解后冷却至40℃，取20ml与20ml细胞浓度为60%的细菌悬液在40℃混合均匀，冷却凝固后切成1~2mm3方块，然后再加2.5%戊二醛，使包埋块悬浮在戊二醛溶液中，室温下轻轻搅拌4小时进行交联，滤去戊醛后，逐次用0.1M氯化钠和去离子水洗涤后即成。或者将明胶-菌体混合液流加到200ml 20℃搅拌下的醋酸丁酯溶液中，当分散成小珠后，迅速加入5ml 5%的戊二醛溶液，继续搅拌5~10分钟，倾去醋酸丁酯，水洗即得到珠型固定化细胞，再放入50ml的pH5.0的戊二醛溶液中浸泡30分钟，然后彻底洗涤，即获得直径1~3mm的球形小珠。使用前将其放入营养液中30℃活化24小时后再用。用戊二醛交联的明胶包埋法，可获得机械强度及工作稳定性较好的固定化细胞。

4）聚丙烯酰胺凝胶包埋法，引此法是较常用的一种包埋法。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂作用下聚合形成三维网状结构的凝胶。常用的催化剂和加速剂是过硫酸铵和四甲乙二胺或三乙醇胺。

称取17.6g丙烯酰胺和1.2g N—N′—甲叉双丙烯酰胺溶于0.05M pH7.0的Tris-HCl缓冲液中，取20ml与5g的湿菌泥混合均匀，加入50μl的40%过硫酸铵，混合均匀后流加到搅拌的豆油或液体石蜡中，搅拌分散成小滴，迅速加入250μl的四甲基乙二胺，小滴即很快聚合形成小珠，倾去流体，用水或缓冲液充分洗涤即可获得珠型固定化细胞。或将菌泥混合液加入1%过硫酸铵0.25ml和10%三乙醇胺4 ml，将上述混合液搅拌均匀，不要出现气泡，置于40℃恒温浴中30分钟左右，即形成聚内烯酰胺凝胶固定化细胞，在凝胶未干时切成2~3mm3小块，于50~60℃中干燥后保存。使用前将包埋好的固定化细胞放入消毒后的营养液中活化24小时再用。

【理化性质】市售戊二醛的含量为25%～50%（重量/体积），是无色或淡黄色的油状液体，沸点为187～189℃，呈中性。在37℃以上蒸汽中可挥发，但不燃烧。可以任何比例与水或醇混合，也可以溶于其他有机溶剂。戊二醛水溶液呈弱酸性（pH4～5）。在4℃时稳定，随着温度升高，聚合速度加快。在酸性条件下相当稳定，随着溶液pH增高，聚合速度加快。pH高于9时，可迅速聚合。在酸性水溶液中，戊二醛单体水化成3种水化物和1种类缩醛聚合体，它们之间相互平衡。在25℃时，溶液中存在少量一水化物和二水化物，戊二醛单体为15%；当温度为75℃时，戊二醛单体为60%。因此，在酸性溶液中随着温度升高而产生更多的自由醛基，提高了其生物学活性。在碱性水溶液中，戊二醛可以聚合成丁间醇醛型不饱和多聚体，并且随时间的延长和pH的升高，可发展成为更高的聚合形式。【作用与用途】戊二醛为强杀菌消毒药，在碱性水溶液（pH 7.5～8.5）的杀菌作用较福尔马林强2～10倍，可杀灭细菌、芽孢、真菌和病毒，具有广谱、高效、速效和低毒等特点。戊二醛使用时，可用碱性启动剂配成2%碱性戊二醛，亦可加入聚氧乙烯脂肪醇醚配成不同浓度的强化酸性戊二醛。研究证明，碱性戊二醛和强化酸性戊二醛均具有广谱、高速、高效杀灭细菌繁殖体、芽孢、细核杆菌、真菌和病毒等，且稳定性较强，故使用价值较高。近年来，水产养殖业已开始使用戊二醛，广泛用于池塘水体消毒。【用法与用量】每1米3水体用40毫克（以戊二醛计），可较好杀灭体表的病毒、细菌等病原微生物。【注意事项】（1）戊二醛对皮肤黏膜刺激较小，但长期接触可引起过敏反应。

（2）使用时避免用含铅等的金属容器。

戊二醛：

O=CHCH2CH2CH2CH=O 很容易被空气中的氧氧化成戊二酸，白色沉淀多源于此。

戊二醛本身也容易发生羟醛缩合，也会产生白色沉淀。

这两类反应都是不可逆的，无法恢复到戊二醛。

建议你将骨组织取出，用酒精清洗，重新泡入新鲜酒精中。

戊二醛消毒剂属高效消毒剂，具有广谱、高效、低毒、对金属腐蚀性小、受有机物影响小、稳定性好等特点。适用于医疗器械和耐湿忌热的精密仪器的消毒与灭菌。戊二醛消毒剂的杀菌原理：醛类消毒剂对微生物的杀灭作用主要依靠醛基，此类药物主要作用于菌体蛋白的疏基、羟基、羧基和氨基，可使之烷基化，引起蛋白质凝固造成细菌死亡。

戊二醛消毒剂使用注意事项：

1、诊疗器械、器具与物品在消毒前应彻底清洗、干燥。新启用的诊疗器械、器具与物品先除去油污及保护膜，再用清洁剂清洗去除油脂，干燥后及时消毒或灭菌。

2、戊二醛消毒剂对人有毒性，应在通风良好的环境中使用。对皮肤和黏膜有刺激性，使用时应注意个人防护。不慎接触，应立即用清水连续冲洗，必要时就医。

3、戊二醛消毒剂不应用于物体表面的擦拭或喷雾消毒、室内空气消毒、手和皮肤黏膜的消毒。

4、强化酸性戊二醛消毒剂使用前应先加入pH调节剂（碳酸氢钠），再加防锈剂（亚硝酸盐）充分混匀。

5、用于浸泡灭菌的容器，应洁净、密闭，使用前应先经灭菌处理。

6、在20℃～25℃温度条件下，加入pH调节剂和亚硝酸钠后的戊二醛消毒剂连续使用时间应≤14d。

7、应确保使用中戊二醛消毒剂浓度符合产品使用说明的要求。

8、戊二醛消毒剂应密封，避光，置于阴凉、干燥、通风的环境中保存。

①GB 26372-2010 《戊二醛消毒剂卫生标准》，本标准规定了戊二醛消毒剂的原料要求和技术要求、应用范围、使用方法、检验方法、标志和包装、运输和贮存、标签和说明书及注意事项。本标准适用于以戊二醛，或戊二醛加脂肪醇聚氧乙烯醚，或戊二醛加十二烷基二甲基苄基氨化铵，或戊二醛加十二烷基二甲基苄基溴化铵为主要成分；以pH调节剂（碳酸氢钠）、防锈剂（亚硝酸钠）等为辅助成分，其最终戊二醛的浓度范围为2.0%～2.5%的消毒剂。但本标准不适用于较低浓度（2.0%以下）的戊二醛消毒剂。

②WS/T 367-2012 《医疗机构消毒技术规范》中的附件部分（C. 8.1）对戊二醛的适用范围、使用方法、注意事项等做了规定。

③GB 15982-2012 《医院消毒卫生标准》中5.2消毒产品使用管理中的5.2.2。

④WS 507-2016《软式内镜清洗消毒技术规范》。5.3.11和附录B涉及到戊二醛。

（来源：GB 26372，GB 15982，WS/T 367，WS 507）

需要说明的是：CSSD作为主要的使用戊二醛的部门，在其WS 310中并没有关于戊二醛的信息。因此，CSSD中的人员需要熟悉以上四个标准/规范。

至于以上四个标准的具体规定，将在下面的问题中具体列出。