该工作仓采用优质不锈钢，可有效分离固体样品表面及内部微生物等样品，无菌均质袋有效隔离样品与设备接触具有均质柔和、无污染、无损伤、无升温、无需灭菌处理等优点。适当调整工作时间和拍击速度可对组织细胞实现柔
1恒温培养箱：36℃±1℃；
2冰箱：2℃——5℃；
3恒温水浴箱：37℃——65℃；
4天平：感量01克；
5均质器；
6振荡器；
7无菌吸管：1毫升（具备001毫升刻度）、10毫升（具备01毫升刻度）或微量移液器及吸头；
8无菌锥形瓶：容量100ml、500ml；
9无菌培养皿：直径90mm;
10注射器：05ml；
11PH计或PH比色管或精密PH试纸。
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标准编号:GB/T 47892-2008
标准名称:食品卫生微生物学检验 菌落总数测定
标准状态:现行
英文标题:Microbiological examination of food hygiene - Aerobic plate count
替代情况:替代GB/T 47892-2003
实施日期:2009-3-1
颁布部门:中华人民共和国卫生部 中国国家标准化管理委员会
内容简介:本标准代替GB/T 47892-2003《食品卫生微生物学检验 菌落总数测定》。
本标准规定了食品中菌落总数的测定方法。
本标准适用于各类食品中菌落总数的测定。
本标准与GB/T 47892-2003相比主要修改如下：
———培养基由营养琼脂改为平板计数琼脂；
———对菌落总数的计算公式进行了修改；
———增加了第二法“菌落总数PetrifilmTM测试片法”。
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均质器的选择有很多，要看样品是固体还是液体，刀头的选择也不同，处理量多大，转速要求等等。
在实验室中，不仅要求样品处理得精细、均匀，还要求接触样品的容器容易清洗，以免样品残留，污染下一个样品，影响测定结果；而在微生物检测实验中，不仅要求容器容易拆卸清洗，而且要求与样品接触的容器、刀头等配件，必须经121℃高温高压灭菌。
如果是无菌的均质要求，可以选择选择拍打式均质器，每次处理样品试用无菌的均质袋，减少了反复灭菌的繁杂过程。英国seward的均质器保质期很长，实验效果也不错。
一、无菌室和超净工作台
是实验室的核心部分，主要为样品提供保护，保证实验结果的准确和人员的安全。
（一）无菌室
无菌室通过空气的净化和空间的消毒为微生物实验提供一个相对无菌的工作环境。无菌室的主要组成设备的空气自净器，传递窗，紫外线灯等。严格的无菌室可能还装备风彬室等。
（二）超净工作台
超净工作台作为代替无菌室的一种设备，使用简单方便，为实验的开展提供一个相对无菌的操作台。超净工作台湾队根据风向分为水平式和垂直式。
二、培养箱
主要用于实验室微生物的培养，为微生物的生长提供一个适宜的环境。
（一）普通培养箱：一般控制的温度范围为：室温＋5～65度，又分为电热恒温培养箱和隔水式恒温培养箱。
（二）生化培养箱：一般控制的温度范围为：5～50度。
（三）恒温恒湿箱：一般控制的温度范围为：5～50度，控制的湿度范围为：50～90％。可作为霉菌培养箱。
（四）厌氧培养箱：适用于厌氧微生物的培养。
三、电热干燥箱：用于吸管，平皿类玻璃器皿的干热、灭菌和烘烤。
四、高压蒸汽灭菌器（又叫高压灭菌锅）：物品的灭菌。
五、天平：一般要求具备精度达到万分之一的分析天平。
六、显微镜：观察细菌形态和动力、微生物和微小物品结构的必备仪器。
七、分光光度计：在QS中用于生产方便面，茶饮料，肉制品，乳制品，棉白糖的企业。
八、酸度计：在QS中用于生产果蔬罐头，白沙糖，饮用水类的企业。
九、电导率仪和浊度仪:在QS中用于生产饮用水的企业。
十、折光仪:在QS中用于生产果蔬罐头，饮料类的企业。
十一、恒温水温浴锅:在QS中用于部分培养温度需要水浴（如大肠杆菌检验）生产方便面，速冻面米食品企业。
十二、定氮装置:在QS中用于生产乳制品，含蛋白质饮料的企业。
杂质度过滤机:在QS中用于生产乳品企业。
均质器：用于均质样品，有旋转刀片式和拍击式可以选择。
常规玻璃器皿
一、 吸管：用于吸取少量液体，常用的吸管为01刻度1mL及10刻度的10mL吸管。
二、培养皿：为硬质玻璃双碟，常用于分离培养，盖与底大小应合适，常用规格为90mm。
三、三角烧瓶与广口瓶：多用于盛培养基及配制溶液，常用的规格有250mL、500mL、1000mL。
四、烧杯：供盛液或煮沸用，常用的规格为100mL、250mL、500mL、1000mL
五、量筒：用于液体测量，常用规格为100mL、250mL、1000mL
六、试管：用于细菌培养，有多种规格。
七、载玻片盖玻片：细菌涂片观察用。
八、试剂瓶：装试剂用，常用棕色避光
九、其它，如试管架、毛刷、酒精灯、接种针、接种环等
实验室配套常用设备
一、通风柜
二、离心机
三、纯水器
四、烘箱
五、低温冰箱实验室常用消耗品(净化工作台)
六、其他
（一）实验室耗材（枪头）、振荡器、菌落计数器、电位 pH计、高速离心机、离心管、试管、巴氏吸管、枪头盒、培养皿、细胞培养板、酶标版、过滤器、移液管、接种环、接种针、比色皿、培养板、PCR管、量筒烧杯。
（二）常用设备，如铁架台、升降台、滴定台、镊子、搅拌子、各种刷子、药勺、滤纸、三脚架、支架，等等。
GB47893—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》第一法：大肠菌群MPN计数法。第二法：大肠菌群平板计数法。两种方法适用于各类食品中大肠菌群的计数。
大肠菌群（Coliforms）是一群在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，其主要检测意义在于反映食品卫生状况并推测其存在肠道致病菌的可能性。常以大肠菌群作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
第一法：
进入无菌操作室前应更换无菌实验服，戴帽子、口罩、无菌手套。进入无菌操作室后，将镊子在酒精灯外焰充分灼烧，夹取适量酒精棉全面擦拭双手，然后才能进行实验操作。酒精易燃，因此在擦拭双手的过程中应离开酒精灯火焰一定距离，防止出现危险，待手上的酒精挥发后，再进行实验操作。
样品的稀释：取一洁净无菌均质袋于自动稀释仪上，将称样勺于酒精灯外焰灼烧片刻，准确称取25g样品于无菌均质袋中。用酒精灯外焰灼烧注水口片刻，在盛有样品的均质袋中注入225mL无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液。取下均质袋，将均质袋放入拍击式均质器中，用均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。
注意：样品匀液的pH值应在65～75之间，必要时可用1mol/L无菌氢氧化钠或1mol/L无菌盐酸溶液调节。均质完毕后，将均质袋置于样品框中。用记号笔依次在无菌试管上做好样品和稀释度标记。用无菌吸管吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入装有9mL生理盐水的无菌试管中。稀释前后试管口都应在酒精灯上灼烧片刻。加塞后于振荡器上混合均匀，制成1:100的样品匀液。根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。稀释样品时，注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面；每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。
初发酵试验：每个样品选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL。注意，当接种量超过1mL，则用双料LST肉汤，双料LST肉汤是指配置时除蒸馏水外其他成分加倍的培养基。
本次试验中，前三管无菌试管中加入10mL十倍样品稀释液，培养基为双料LST肉汤；第4～6管加入十倍稀释液1mL，培养基为单料肉汤；第7～9管加入百倍稀释液接种1mL，培养基为单料肉汤；接种前后试管口均需用酒精灯灼烧片刻，接种后及时振摇均匀。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。
接种完毕后，将LST肉汤管置于培养箱中36℃±1℃条件下培养24h±2h。24h±2h后，观察试管中的倒管内是否有气泡产生，产气者进行复发酵试验；如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验，未产气者报告为大肠菌群阴性。
复发酵试验：进行复发酵试验时，先将接种环置于红外灭菌器中灭菌，再用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，接种完毕后应及时将接种环在灭菌器中灭菌。将接种完的煌绿乳糖胆盐肉汤管置于培养箱中，36℃±1℃下培养48h±2h。36℃±1℃培养48h±2h后，观察产气情况，若试管中的倒管内有气泡，计为大肠菌群阳性管，否则计为大肠菌群阴性。
四结果报告
按确证的大肠菌群LST阳性管数，参照GB47893—2010附录中提供的大肠菌群最可能数检索表，报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。
第二法：
样品处理：固体样品应在无菌条件下充分粉碎。本次演示以乳粉为例，取密封状态良好的试样，备用待测。
检测过程：
在装有9mL生理盐水的无菌试管上做好标记，用1mL无菌吸管吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入装有9mL生理盐水的无菌试管中，稀释前后试管口都应在酒精灯上灼烧片刻。加塞后于振荡器上混合均匀，制成1:100的样品匀液。同理，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。稀释样品时，注意吸管或吸头尖端不得触及稀释液面；每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。
接种及培养：在事先经灭菌处理的培养皿底部做好标记。根据对样品污染状况的估计，选取2～3个适宜的连续稀释度。本次演示只做1:10和1:100的样品稀释液。
用无菌吸管吸取1:10样品稀释液1mL，加入到培养皿中，备用。同理，加入1:100稀释液和空白液。注意，每个稀释度应接种2个无菌培养皿，空白液即为以1mL生理盐水代替1mL样品稀释液。
加完样品梯度稀释液后，即可倾倒培养基。倾倒前应将锥形瓶的瓶口在酒精灯上充分灼烧。灼烧后及时倾注15mL～20mL结晶紫中性红胆盐琼脂于每个培养皿中，小心旋转培养皿，将培养基与样液充分混匀。倾注培养基时应将锥形瓶口尽量伸入培养皿内，防止倾倒时培养基挂在培养皿的内壁或外壁上，且倾倒过程应果断，防止培养基沿锥形瓶外壁流出、滴落。培养基的温度以46℃为宜，不能过高或过低，温度过高不利于操作且对菌体有害，温度过低培养基迅速凝固，菌体不能在培养皿内均匀的分布，导致菌落计数困难。转动培养基时用力须均匀，防止培养基沾到培养皿上盖或洒出。
倒完培养基后，静置培养皿，等待培养基冷却凝固。
待培养基凝固后，再加3mL～4mL结晶紫中性红胆盐琼脂覆盖平板表层。加两次培养基的主要目的是：使菌体均在培养基内部生长，以便于观察典型菌落形态。等待培养基冷却凝固。待培养基凝固后，翻转平板，置于培养箱中于36℃±1℃条件下培养18h～24h。
平板菌落计数：选取菌落数在15CFU～150CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落，其中典型菌落的特征为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为05mm或更大。
证实实验：先在煌绿乳糖胆盐肉汤管上做好标注。将接种环置于红外灭菌器中灭菌，再用接种环从结晶紫中性红胆盐琼脂平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于煌绿乳糖胆盐肉汤管内，振摇均匀。每次接种后都应及时将接种环在灭菌器中灭菌。将接种完的煌绿乳糖胆盐肉汤管置于培养箱中，于36℃±1℃条件下培养24h～48h。培养完毕后，观察煌绿乳糖胆盐肉汤管中产气情况。凡管内倒管有气泡者，即可报告为大肠菌群阳性。
四结果报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。
